肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）起病隐匿，早期临床症状缺乏特异性。现有筛查与辅助诊断主要依赖影像学检查及甲胎蛋白等血清蛋白标志物，但部分早期HCC患者相关标志物水平升高不明显。因此，发掘具有潜在诊断价值的新型分子标志物，并建立与之适配的灵敏、快速检测方法，是提升HCC早期识别能力的重要研究方向。最新肝癌诊疗指南明确指出，miRNA异常表达与HCC的发生发展密切相关，其中miR-21上调和miR-122下调具有潜在的辅助诊断价值，也为HCC的非侵入性检测提供了新的分子依据。然而，miRNA具有序列短、丰度低及高度同源等特点，传统检测方法通常依赖逆转录和核酸扩增，不仅操作流程复杂、检测时间较长，而且存在扩增产物污染风险，限制了其在现场快速检测中的应用。

围绕“如何在无逆转录、无预扩增条件下实现HCC相关miRNA的灵敏、特异和可视化检测”这一科学问题，我院王晓琨副教授团队构建了模块化CRISPR–Cas12a可视化检测平台。该平台以通用骨架RNA（scRNA）为组装支架，使目标miRNA直接参与形成具有活性的crRNA；组装后的crRNA引导Cas12a识别预构建的双链DNA激活子，并触发其反式切割活性。该设计将目标miRNA由传统意义上的“待扩增分析物”转化为CRISPR识别复合物的功能性组分，从而绕开逆转录和预扩增步骤，为短链、低丰度miRNA的直接检测提供了新的分子识别与信号转导路径。

图1.检测原理及操作示意图

在此基础上，团队进一步构建了两种相互补充的可视化读出模式。在均相非交联聚集比色体系中，利用Cas12a反式切割调控DNA与金纳米颗粒（AuNPs）之间的相互作用及AuNPs的聚集状态，产生可直接观察的颜色变化。与传统交联聚集模式相比，该策略无需长链单链DNA连接子，具有反应动力学快、信噪比高和体系构成简洁等优势。在磁珠报告探针侧向层析体系中，以磁珠表面部分杂交的DNA探针作为Cas12a反式切割底物，切割后释放的标记DNA片段在试纸条测试线富集并形成红色条带，实现由目标物触发的“信号开启”式检测。该设计减少了传统CRISPR侧向层析体系中探针持续消耗、测试线竞争捕获及对照线异常等问题，使检测结果更加直观和稳定，并将检测限较传统CRISPR试纸条降低约200倍。

分析性能评价结果表明，该双模式平台能够对HCC相关miRNA进行灵敏、特异的可视化检测，并可通过更换相应的miRNA识别序列实现检测对象的模块化拓展。其中，均相非交联聚集模式具有响应快速、操作简便和信噪比高等特点；磁珠报告探针侧向层析模式则兼具结果直观、信号稳定和现场应用潜力。在临床血清样本的初步验证中，两种检测模式与RT-qPCR结果均具有良好一致性。ROC分析进一步表明，miR-21与miR-122联合检测具有较高的HCC识别能力，并可为传统血清蛋白标志物正常或低表达患者提供补充性分子信息，展现出用于HCC辅助诊断的潜在价值。

相关成果以“Modular CRISPR–Cas12a-Activated Gold Nanoparticle Assay for Rapid Visual Detection of Hepatocellular Carcinoma-Related miRNAs”为题发表于《ACS Sensors》（一区，影响因子10.9），论文第一作者为williamhill威廉希尔硕士研究生孙颖慧。该研究得到国家自然科学基金、山东省自然科学基金等项目资助。

图2.临床样本分析性能验证